HPLC原理及基本操作是什么？

原理

高效液相色谱法仪根据各种各样的相互作用力来分离混合物。这种相互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。

使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物中不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪。采用高压输液泵，高效固定相和高压灵敏检测器等装置的液相色谱仪成为高效液相色谱仪。高效液相色谱仪种类繁多，但不论何种类型的高效液相色谱仪，基本上都分为4个部分：高压输液装置，进样系统，分离系统和检测系统。

操作

将要分离和分析的样品混合物以不连续的小体积（通常为微升）引入渗透通过色谱柱的流动相流中。样品的组分以不同的速度通过色谱柱，这是与吸附剂（也称为固定相）的特定物理相互作用的函数。每个组分的速度取决于其化学性质，固定相（柱）的性质以及流动相的组成。

特定分析物洗脱（从色谱柱中出现）的时间称为其保留时间。在特定条件下测得的保留时间是给定分析物的识别特征。

可以使用许多不同类型的色谱柱，其中填充了粒径，孔隙率和表面化学性质各异的吸附剂。使用较小的颗粒尺寸的包装材料需要使用较高的操作压力（“背压 ”）的和通常改善的色谱分辨率（连续的分析物从柱中出现的峰之间的分离度）。吸收剂颗粒本质上可以是疏水的或极性的。

常用的流动相包括水与各种有机溶剂的任何混溶性组合（最常见的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技术使用无水流动相（请参见下面的正相色谱法）。

流动相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或盐以帮助分离样品成分。在色谱分析过程中，流动相的组成可以保持恒定（“等度洗脱模式”）或变化（“梯度洗脱模式”）。等度洗脱通常在分离与固定相亲和力非常不同的样品成分时非常有效。

在梯度洗脱中，流动相的组成通常从低到高洗脱强度变化。流动相的洗脱强度由分析物的保留时间反映，高洗脱强度可产生快速洗脱（=较短的保留时间）。

反相色谱中的典型梯度曲线可能始于5％的乙腈（在水或水性缓冲液中），然后在5–25分钟内线性增长至95％的乙腈。恒定流动相组成的周期可以是任何梯度曲线的一部分。例如，流动相的组成可以在5％的乙腈中保持1-3分钟，然后线性变化直至95％的乙腈。

流动相的选定组成取决于各种样品组分（“分析物 ”）和固定相之间的相互作用强度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根据它们对固定相和流动相的亲和力，在色谱柱中进行分离过程中，分析物会在两者之间分配。

此分配过程类似于液-液萃取过程中发生的分配过程，但该过程是连续的，而不是逐步进行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脱，一旦流动相在乙腈中的浓度更高（即，在洗脱强度更高的流动相中），则更多的疏水性组分将较晚洗脱（从色谱柱中洗脱）。

流动相组分，添加剂（例如盐或酸）和梯度条件的选择取决于色谱柱和样品组分的性质。通常对样品进行一系列的试验，以便找到可以充分分离的HPLC方法。

用途

高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医药品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。

高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。例如：可检测分析食品中的三聚氰胺的含量。